细胞培养

是把取得的组织用机械或消化的方法分散成单个细胞，然后在体外进行培养。按培养的时间分为原代培养和传代培养；按培养细胞的生长方式则可分为贴附培养和悬浮培养。

【原理】
从组织分离的细胞模拟动物体内的生存环境，在体外进行培养。其组织来源众多，可以是动物的胚胎或成体，亦可以是正常组织或肿瘤组织等。分离培养的细胞经鉴定筛选后可作为临床及科研相对应的研究对象进行分析。

【应用范围】
随着细胞生物学和分子生物学等技术的不断发展及交叉渗透，细胞培养技术在各领域的应用范围也愈来愈广，其主要应用领域有：
1. 免疫学
最突出的例子就是单克隆抗体技术。杂交瘤-单克隆抗体技术的发明极大的促进了免疫学的发展。而这种技术就是在细胞培养技术的基础上发展起来的。
2. 病毒学
近年来病毒学中很多发展与能在培养细胞中生长病毒的技术有关。以往病毒学的研究、实验常需大量动物，且检测技术较繁琐而重复性较差；现已可采用细胞培养技术，作斑点分析等而代替，方法简单，准确而且重复性好。另外，由于很多病毒疾病可用抗体血清治疗，因此需要能够生长大量病毒以用于产生疫苗及鉴定，这些工作常可利用培养的细胞进行研究。如A293细胞可以作为病毒的宿主细胞进行扩增及作检测病毒的滴度的靶细胞用等。
3. 遗传学
利用细胞培养技术进行染色体分析。由于细胞融合技术的引入，与遗传学技术相结合建立了体细胞遗传学，并已成为包括人在内的高等脊椎动物遗传学分析的一个重要的组成部分。
4. 肿瘤学
细胞培养技术已广泛应用于肿瘤学的领域，促进了对肿瘤的了解。例如：利用细胞培养技术进行的细胞转化作用改变细胞原来的性质，被认为是研究肿瘤发生的良好方法。肿瘤细胞的分离及细胞株的建立，对于临床及科研的发展起到了极大的推动作用。
5. 分化及发育
高等动物真核细胞分化的研究是比较困难的。但利用体外培养对分化进行研究，则提供了很大的方便，例如：经一已知的外界因素刺激后，有些细胞群体可发生改变，这些改变可以被确认并进行监测，并可研究细胞及发育过程中相互作用及细胞内控制的机制等。
6. 细胞毒试验
在细胞培养技术的应用，日益广泛的是进行多种物质的毒性试验。虽然体外培养细胞的结果尚不能完全反应出整个动物的情况；但可以说，若某一物质对几种不同的细胞系均产生有害的影响，当把这物质使用于整个动物时，预期产生不良效应的可能性极大。如NK细胞的活性检测、CTL细胞毒性试验及化疗药物对肿瘤细胞的杀伤等。
7. 临床医学及生物技术方面的应用
细胞培养技术已为临床医学所采用，例如：从子宫取得细胞做染色体分析可揭示尚为出生胎儿的遗传性疾患；在合适的宿主细胞的培养可做病毒感染的定性及定量分析；以细胞培养作克隆、微量分析或其他体外检测分析方法检测药物的效应。此外，并已用于某些治疗目的，如将某些细胞体外培养，经适当处理后重新导入动物体内以达到治疗目的，例如：经体外刺激生长的淋巴细胞可用以改善对肿瘤的免疫反应、LaK细胞的应用等。

【临床意义】
目前本科室应用细胞培养技术开展的项目有：肿瘤细胞药物敏感性试验（TJST）、粒单祖细胞集落形成单位（CFU-GM）、红系祖细胞集落形成单位（CFU-E）、爆增红祖细胞集落形成（BFU-E）及混合淋巴细胞培养（MLR）等。
1. TJST主要应用于临床肿瘤患者的化疗药物筛选，预期评价各类化疗药物对该肿瘤患者的疗效。
2. CFU-GM、CFU-E和BFU-E主要测定血液病患者造血祖细胞的定向增殖分化能力。
3. MLR检测常用于器官移植前的组织配型，以测定受体和供体主要组织相容性抗原(HLA抗原)相容的程度。
【项目名称】
红系祖细胞集落形成试验（CFU-E）

【检验目的】
观察造血祖细胞在促红细胞生成素（EPO）的体外刺激下，定向增殖分化的能力。

【主要试剂和仪器】
肝素、Ficoll淋巴细胞分离液、EPO 、D-Hank's平衡液、甲基纤维素、RPMI-1640细胞培养基、胎牛血清、CO2细胞培养箱、倒置显微镜等、24孔细胞培养板等。

【操作程序】
1. 取肝素抗凝（20U/ml）骨髓1~2ml， D-Hank's平衡液作1:4稀释；
2. 加等量的Ficoll于离心管中，再沿管壁缓慢加入预稀释的骨髓液；
3. 离心400g×30min，加速度为3g/s，减速度3g/s；
4. 吸取单个核细胞层，预冷的D-Hank's 1:1稀释洗涤2次，细胞计数；
5. 用含有0.75%甲基纤维素的RPMI-1640完全培养基（20%胎牛血清）调细胞悬液为2×105/ml；
6. 加1ml/孔于24孔培养板中，每孔再加20U EPO ，同时设3个复孔；
7. 37℃，5%CO2培养10天。3个复孔分别计数，取平均值作为报告值。

【正常参考值】
CFU-E集落 5~10/106 MNC,大丛10~20/106 MNC，小丛50~100/106MNC

【临床意义】
①再生障碍性贫血：BFU－E、CFU－E均减少，以后者更甚，与疾病严重程度一致。
②单纯红细胞再生障碍性贫血：CFU－E减少，对促红细胞生成素（EPO）反应低下。
③急性白血病细胞浸润明显时：CFU－E、BFU－E均减少，对EPO反应低下。
④慢性粒细胞性白血病：BFU－E、CFU－E均增高并可分化成熟。
⑤原发或继发性铁粒幼细胞贫血：BFU－E、CFU－E集落形成均减少。
⑥真性红细胞增多症：BFU－E、CFU－E均增高，且后者对EPO感受性增强。

◆附注：
CFU-E细胞聚集数>50为集落，30~50为大丛，10~20为小丛，<10不计。

【项目名称】
粒单双向祖细胞集落形成试验（CFU-GM）

【检验目的】
观察造血祖细胞在集落刺激因子（GM-CSF）的体外诱导下，定向增殖分化的能力。

【主要试剂和仪器】
肝素、Ficoll淋巴细胞分离液、GM-CSF 、D-Hank's平衡液、甲基纤维素、RPMI-1640细胞培养基、胎牛血清、CO2细胞培养箱、倒置显微镜等、24孔细胞培养板等。

【操作程序】
8. 取肝素抗凝（20U/ml）骨髓1~2ml， D-Hank's平衡液作1:4稀释；
9. 加等量的Ficoll于离心管中，再沿管壁缓慢加入预稀释的骨髓液；
10. 离心400g×30min，加速度为3g/s，减速度3g/s；
11. 吸取单个核细胞层，预冷的D-Hank's 1:1稀释洗涤2次，细胞计数；
12. 用含有0.75%甲基纤维素的RPMI-1640完全培养基（20%胎牛血清）调细胞悬液为2×105/ml；
13. 加1ml/孔于24孔培养板中，每孔再加20U GM-CSF ，同时设3个复孔；
14. 37℃，5%CO2培养10天。3个复孔分别计数，取平均值作为报告值。

【正常参考值】
CFU-GM集落 20~30/2×105 MNC,大丛35~50/2×105 MNC，小丛50~200/2×105 MNC

【临床意义】
①白血病的辅助诊断、治疗监测与预后判断。
②按生长类型将骨髓增生异常综合征(MDS)分二类：Ⅰ型为非白血病生长型，Ⅱ型为白血病生长型，后者易转变为NALL，且中数生存期短。
③再生障碍性贫血多数人集落、簇生长均减少，其中CFU－GM数不减少者预后好，缓解病例可见CFU－GM上升。
④真性红细胞增多症如伴白细胞增高，则CFU－GM增多；如转变为急性白血病，则CFU－GM减少。
⑤骨髓纤维CFU－GM减少。
◆附注：
CFU-GM细胞聚集数>50为集落，30~50为大丛，10~20为小丛，<10不计。